В световом флуоресцентном микроскопе препарат подсвечен осветителем целиком. Изображения всех частей препарата на луче зрения накладываются друг на друга. В отличие от этого, в конфокальном микроскопе используется точечный источник света и маленькая диафрагма, расположенная в оптически сопряженной плоскости перед приемником света, чтобы исключить информацию от частей препарата, расположенных не в фокусе. Отсюда название «конфокальный» - с сопряженным фокусом. Детектируется только свет, идущий из фокальной плоскости. Последовательной перефокусировкой можно исследовать препарат «по слоям», и с помощью компьютера собрать из них «трехмерное» изображение препарата.